賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實驗時的影響因素有？

　　賽默飛Veriti96梯度PCR儀采用了成熟的帕爾貼技術(shù)準確控制升降溫度，多重溫度探針檢測系統(tǒng)，確保每臺儀器穩(wěn)定可靠運行。每一個加熱孔都經(jīng)過準確計算，升溫更快，溫控更準確，保證實驗穩(wěn)定進行。

　　本產(chǎn)品能夠滿足實驗室的需求和研究者的實驗要求，出色地完成普通PCR、梯度PCR、長片段擴增、恒溫酶切和連接等實驗等試驗；同時它還采用簡單的操作面板，很好的精度和穩(wěn)定性保障結(jié)果再現(xiàn)，升降溫速率快，Z高可達3度/秒，12步梯度選擇。

　　使用賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實驗時有哪些影響因素？

　　1、酶及其濃度

　　目前有兩種TaqDNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

　　2、dNTP的質(zhì)量與濃度

　　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris.HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

　　3、溫度與時間的設置

　　基于賽默飛Veriti96梯度PCR儀原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。